乙酰dan堿酯酶（AchE）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

AchE 屬于絲an酸水解酶，廣泛存在于各種動(dòng)物組織和血清中。AchE 催化乙酰dan堿（Ach）水解，在神經(jīng)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中起重要作用。

測(cè)定原理：

AchE 催化Ach 水解生成dan堿，dan堿與二硫?qū)ο趸郊姿?/span>（DTNB）作用生成 5-巰基-硝基苯甲酸（TNB）； TNB 在 412nm 處有吸收峰，通過(guò)測(cè)定 412 nm 吸光度增加速率，計(jì)算 AchE 活性。

乙酰dan堿酯酶活性測(cè)定試劑盒  P450系列

組成：

試劑三：粉劑×1 支，4℃保存。臨用前加入 1.3 ml 試劑二，充分震蕩溶解。試劑四：粉劑×1 支，4℃保存。臨用前加入 1.3 ml 試劑二，充分震蕩溶解。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心 10min，取上清液待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g， 4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

3. 取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 20μl 上清液、160 μl 試劑二、10μl 試劑三和 10μl 試劑四，迅速混勻，于412nm 處測(cè)定3min 內(nèi)吸光值變化，第10s 吸光值記為A1，第190s 吸光值記為A2。△A 測(cè)定管=A2-A1。 AchE 活性計(jì)算：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 組織AchE 活性

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷（Cpr ×V 樣）÷T

= 245×△A÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/g 鮮重)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T

= 245×△A÷W

2. 細(xì)菌、細(xì)胞AchE 活性

活性單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T

= 245×△A÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清AchE 活性

活性單位定義：每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min /ml)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷V 樣÷T

=245×△A

ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，13.6×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L）， 200μl=2×10^-4L；V 樣總：提取液體積，1 ml；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：蛋白濃度（mg/ml）；V 樣：加入上清液體積（ml），0.02 ml；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時(shí)間（min），3 min。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 組織AchE 活性

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷（Cpr ×V 樣）÷T

= 490×△A÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/g 鮮重)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T

= 490×△A÷W

2. 細(xì)菌、細(xì)胞AchE 活性

活性單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T

= 490×△A÷細(xì)胞數(shù)量

3. 血清AchE 活性

活性單位定義：每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min /ml)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷V 樣÷T

=490×△A

ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，13.6×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L）， 200μl=2×10^-4L；V 樣總：提取液體積，1 ml；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：蛋白濃度（mg/ml）；V 樣：加入上清液體積（ml），0.02 ml；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時(shí)間（min），3 min。

乙酰dan堿酯酶活性測(cè)定試劑盒  P450系列